植物激素类次生代谢产物的生物活性测定 细胞学评价法
Determination of the biological activity for plant hormone-related secondary metabolites - Cytological method
1 范围
本标准规定了用细胞学评价法测定植物激素类次生代谢产物生物活性的方法。
本标准适用于植物激素类次生代谢产物生长素、细胞分裂素和赤霉素的活性测定。
2 规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文
件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
3 术语和定义、缩略语
3.1 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1.1
植物激素类次生代谢产物
来自植物自身合成的以及通过微生物发酵或化学合成获得的具有调控植物生长、发育与休眠的活性物质。
3.1.2
生物活性
单位浓度的植物激素类次生代谢产物与其相对应的标准物促进或抑制植物生长、发育与休眠能力的相对值。
3.2 缩略语
下列缩略语适用于本文件。
4-MU:4-甲基伞形酮
4-MUG:4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷
AuxRE∷GUS:生长素响应gus报告基因
CTKRE∷GUS:细胞分裂素响应gus报告基因
DPBS:Dulbecco's磷酸缓冲盐溶液
GA3:赤霉酸
GARE∷GUS:赤霉素响应gus报告基因
GUS:β-葡萄糖醛酸苷酶
NAA:萘乙酸
ZT:玉米素
4 原理
植物激素类活性物质通过与相应的激素受体结合可调节相关蛋白与其靶基因启动子中的激素应答元件结合进而诱导或抑制靶基因表达。选用携带激素响应的gus报告基因的转基因拟南芥原生质体细胞为试验材料,以标准物为参照,根据GUS酶活和标准物浓度对数的线性回归关系得到标准曲线,计算在线性范围内诱导产生的 GUS酶活相同的标准物浓度与试样浓度的比值,表示单位浓度(mg/mL)试样所具有的植物激素类次生代谢产物的生物活性。其中 GUS蛋白可水解4-MUG为
4-MU,由此以37℃水浴条件下每微克GUS蛋白每分钟水解4-MUG产生的4-MU的物质的量来指示
GUS酶活。
5 试剂或材料
除非另有规定,仅使用分析纯试剂。
5.1 水。GB/T 6682一级。
5.2 AuxRE∷GUS细胞系。拟南芥生态型,含有生长素应
答元件AuxREs,携带单拷贝gus基因,活细胞数≥1×106 个/mL。
5.3 GARE∷GUS细胞系。拟南芥生态型,含有赤霉素应
答元件TATC-boxs,携带单拷贝gus基因,活细胞数≥1×106 个/mL。
5.4 CTKRE∷GUS细胞系。拟南芥)生态型,含有细胞分裂
素应答元件ARR1AT,携带单拷贝gus基因,活细胞数≥1×106 个/mL。
5.5 细胞系培养液。不含蔗糖和琼脂的 MS培养基4.74g,加950mL水溶解后,加入30.00g蔗糖,
0.75g氯化钙,0.35g硝酸钾,充分混匀后用氢氧化钠调整pH至5.60,加水定容至1000mL,0.22μm
滤膜过滤除菌。现配现用。
5.6 DPBS,pH7.4。称取氯化钠8.00g,氯化钾0.20g,十二水合磷酸氢二钠2.90g,磷酸二氢钾0.24g,加
水定容至1000mL,混匀后常温保存备用。可使用同类商品化产品。
5.7 抽提液。称取二水合乙二胺四乙酸二钠3.72g,加入700μLβ-巯基乙醇,1mL聚乙二醇辛基苯基
醚,用DPBS溶解并定容至1000mL,混匀后常温保存备用。
5.8 含1mmol/L4-MUG的抽提液。称量105.6mg4-MUG,用抽提液溶解并定容至300mL,现配
现用。
5.9 0.2mg/mL牛血清蛋白溶液。称量20.0mg牛血清蛋白标准品,用DPBS溶解并定容至100mL,
现配现用。
5.10 反应终止液。称取21.20gNa2CO3,用水溶解并定容至1000mL。
5.11 考马斯亮蓝染色液。称取0.5g考马斯亮蓝G-250,溶于50mL90%的乙醇中,并加入DPBS
100mL,用水定容至1000mL,混匀后常温保存。有效期一个月。
5.12 10μmol/L4-MU母液。称取17.6mg4-MU,用反应终止液溶解并定容至10mL,混匀,得到
10mmol/L4-MU溶液。吸取1mL10mmol/L4-MU溶液加入9mL反应终止液,混匀,得到1mmol/L
4-MU溶液。吸取100μL1mmol/L4-MU溶液加入9.9mL反应终止液混匀,得到10μmol/L4-MU
溶液。4℃避光暂存。
5.13 4-MU使用液。吸取200μL10μmol/L4-MU母液,加入至9.8mL反应终止液中,混匀后得到
200nmol/L的4-MU使用液。然后吸取1mL200nmol/L的4-MU,加入1mL反应终止液,混匀后得
到100nmol/L的4-MU使用液,依次两倍稀释,得到50nmol/L、25nmol/L、12.5nmol/L、6.25nmol/L的4-MU使用液。
5.14 NAA。纯度≥98%。
5.15 GA3。纯度≥98%。
5.16 ZT。纯度≥98%。
5.17 1mg/mLNAA标准贮备液。称取10.0mgNAA标准品,用0.5mL无水乙醇溶解,用水定容至
10mL,充分混匀后,4℃冰箱冷藏,保存期1个月。
5.18 1mg/mLGA3 标准贮备液。称取10.0mgGA3 标准品,用0.5mL无水乙醇溶解,用水定容至
10mL,充分混匀后,4℃冰箱冷藏,保存期1个月。
5.19 1mg/mLZT标准贮备液。称取10.0mgZT标准品,用0.5mL无水乙醇溶解,用水定容至10mL,
充分混匀后,4℃冰箱冷藏,保存期1个月。
5.20 NAA标准工作液。吸取200μL1mg/mLNAA标准贮备液,800μL细胞系培养液,混匀,得
2×10-1mg/mLNAA溶液。依次10倍稀释得2.00×10-4mg/mL、2.00×10-5mg/mL、2.00×10-6mg/mL
NAA标准工作液。吸取632μL1mg/mLNAA 标准贮备液,368μL 细胞系培养液,混匀,得
6.32×10-1mg/mLNAA溶液。依次10倍稀释得6.32×10-5mg/mL、6.32×10-6mg/mLNAA标准
工作液。临用前配制。
5.21 GA3 标准工作液。吸取200μL1mg/mLGA3 标准贮备液,800μL细胞系培养液,混匀,得
2×10-1mg/mLGA3溶液。依次10倍稀释得2.00×10-4mg/mL、2.00×10-5mg/mL、2.00×10-6mg/mL
GA3 标准工作液。吸取632μL1 mg/mL GA3 标准贮备液,368μL 细胞系培养液,混匀,得
6.32×10-1mg/mLGA3 溶液。依次10倍稀释得6.32×10-5mg/mL、6.32×10-6mg/mLGA3 标准
工作液。临用前配制。
5.22 ZT标准工作液。吸取200μL1mg/mLZT标准贮备液,800μL细胞系培养液,混匀,得
2×10-1mg/mLZT溶液。依次10倍稀释得2.00×10-3mg/mL、2.00×10-4mg/mL、2.00×10-5mg/mL
ZT标准工作液。吸取632μL1mg/mLZT标准贮备液,368μL细胞系培养液,混匀,得6.32×10-1mg/mL
ZT溶液。依次10倍稀释得6.32×10-4mg/mL、6.32×10-5mg/mLZT标准工作液。临用前配制。
6 仪器设备
6.1 pH计:精度0.01。
6.2 电子分析天平:精度0.1mg、0.01g、1g。
6.3 光照培养箱:25℃±1℃。
6.4 恒温水浴锅:37℃。
6.5 细胞培养板。
6.6 酶标仪:可同时检测吸光度和荧光强度。
6.7 酶标板:黑色。
7 测定步骤
7.1 试样制备
按供试样品的有效物质(或待测物质)质量换算,称量足量固体样品或量取足量液体样品,按产品使
用说明书或待测物质特性选择合适的试剂或水溶解配制有效物质(或待测物质)的溶液作为待测试样,浓度记为ρ0(mg/mL)。待测时用相应缓冲液将待测试样进行5倍或10倍梯度稀释,稀释后浓度记为ρn(mg/mL)。试样至少制备3个浓度梯度,每个浓度样品至少重复测量三次。
7.2 GUS蛋白诱导表达水平测定
7.2.1 试样处理诱导GUS蛋白表达及样品制备
准备3个以上细胞培养板,每个板为一个重复,对每格进行编号,按检测对象选择相应的细胞系和
标准物,将1mL的AuxREs∷GUS细胞系加入细胞培养板的培养孔,每个孔再分别对应加入1mL细
胞系培养液、不同浓度的NAA标准品工作液和不同浓度的试样溶液,做好标记,25℃光照培养箱培养6h进行处理诱导GUS表达。然后将处理后的细胞系转移至10mL离心管,加入1mL抽提液混匀后冰上裂解20min。4℃14000g离心30min后吸取上清液即为样品溶液。
7.2.2 样品中总蛋白浓度的测定
分别吸取0μL、2.0μL、4.0μL、6.0μL、8.0μL、12.0μL、16.0μL、20.0μL标准品牛血清蛋白溶液
加入酶标板加样孔中,加DPBS溶液补足至20.0μL(各孔中牛血清蛋白含量分别为0μg、0.40μg、
0.80μg、0.12μg、0.16μg、2.40μg、3.20μg、4.00μg);根据样品中蛋白含量吸取适量样品(体积为V1)加入酶标板加样孔中,加DPBS溶液补足至20.0μL;每个标准品或样品溶液重复加入3个加样孔,以DPBS溶液为空白对照调零,然后分别加入200μL考马斯亮蓝染色液与标准品或样品溶液混匀,在波长595nm处测量吸光度,以牛血清蛋白含量为横坐标、吸光度为纵坐标绘制标准曲线,并根据式(1)计算样品中总蛋白浓度ρ总。
7.2.3 样品中GUS蛋白酶活测定
取适量样品溶液(使总蛋白含量在20μg~200μg),记录体积V2,加入1mL含有1mmol/L
4-MUG的抽提液,37℃水浴,在水浴5min、25min、45min、65min以及85min时各取出200μL反应
液,加入800μL反应终止液混匀后,吸取200μL加入酶标板加样孔。吸取200μL4-MU 使用液
(4-MU含量分别为200nmol、100nmol、50nmol、25nmol、12.5nmol、6.25nmol),加入酶标板加样孔。
注意,每个样品检测酶标板上均需带上标准品,每个标准品或样品溶液重复加入3个加样孔,以反应终止液为空白对照调零,在激发波长365nm,吸收波长455nm的条件下测量荧光强度。以4-MU标准品浓度为横坐标,荧光强度为纵坐标绘制标准曲线,并通过该标准曲线将样品反应后荧光强度换算为样品反应后实际产生的4-MU的物质的量,最后以样品反应时间为横坐标,样品反应后产生的4-MU的物质的量为纵坐标绘制标准曲线,计算GUS蛋白每分钟水解4-MUG产生4-MU的物质的量n,并根据式(2)计算样品中GUS酶活y。
7.3 标准曲线绘制
按7.2所述测定标准品工作液处理后GUS蛋白诱导表达水平,并参照附录A对数据进行记录。以
10为底取标准品工作液浓度的对数值x为自变量,GUS酶活y为因变量,绘制标准曲线。
7.4 测量
按7.2所述测定试样溶液处理后GUS蛋白诱导表达水平,并参照附录A对数据进行记录。y值在
标准曲线线性范围的试验视为有效试验,记录试样浓度ρn,无效试验所获得的数据应舍去。然后依据有效y值从标准曲线中计算x,依据式(3)计算试样中植物激素类次生代谢产物的生物活性,若有多个有效y值,则按式(3)计算取其平均值。
8 重复性
在重复性条件下获得的三次独立测定结果的绝对值差值不得超过算数平均值的20%。
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