GB 15193.22-2014

GB 15193.22-2014
(National Food Safety Standard 28 days oral toxicity test)
书中华人民共和国国家标准
GB １５１９３．２２-２０１４
食品安全国家标准
２８天经口毒性试验
（报批稿）
２０１４-１２-０１发布
２０１５-０５-０１实施
中 华 人 民 共 和 国
国家卫生和计划生育委员会 发 布
书GB １５１９３．２２-２０１４
食品安全国家标准
２８天经口毒性试验
１　范围
本标准规定了实验动物２８天经口毒性试验的基本试验方法和技术要求。
本标准适用于评价受试物的短期毒性作用。
２　术语和定义
２．１　重复剂量２８天经口毒性
实验动物连续２８天经口接触受试物后引起的健康损害效应。
２．２　未观察到有害作用剂量
通过动物试验，以现有的技术手段和检测指标未观察到任何与受试物有关的毒性作用的最大剂量。
２．３　最小观察到有害作用剂量
在规定的条件下，受试物引起实验动物组织形态、功能、生长发育等有害效应的最小作用剂量。
２．４　靶器官
实验动物出现由受试物引起明显毒性作用的器官。
２．５　卫星组
在毒性研究设计和实施中外加的动物组，其处理和饲养条件与主要研究的动物相似，用于试验中期或试验结束恢复期观察和检测，也可用于不包括在主要研究内的其他指标及参数的观察和检测。
３　试验目的和原理
确定在２８天内经口连续接触受试物后引起的毒性效应，了解受试物剂量-反应关系和毒作用靶器官，确定２８天经口最小观察到有害作用剂量（ＬＯＡＥＬ）和未观察到有害作用剂量（ＮＯＡＥＬ），初步评价受试物经口的安全性，并为下一步较长期毒性和慢性毒性试验剂量、观察指标、毒性终点的选择提供依据。
４　仪器和试剂
４．１　仪器／器械
实验室常用解剖器械、电子天平、生物显微镜、检眼镜、生化分析仪、血球分析仪、凝血分析仪、尿液分析仪、离心机、石蜡切片机等。
GB １５１９３．２２-２０１４
４．２　试剂
甲醛、二甲苯、乙醇、苏木素、伊红、石蜡、血球分析仪稀释剂、生化分析试剂、凝血分析试剂、尿液分析试剂等。
５　试验方法
５．１　受试物
受试物应使用原始样品，若不能使用原始样品，应按照受试物处理原则对受试物进行适当处理。将受试物掺入饲料、饮用水或灌胃给予。
５．２　实验动物
５．２．１　动物选择
实验动物的选择应符合GB １４９２２．１和GB １４９２２．２的有关规定。选择已有资料证明对受试物敏感的物种和品系，一般啮齿类动物首选大鼠，非啮齿类动物首选犬（通常选用Ｂｅａｇｌｅ犬）。大鼠周龄推荐不超过６周，体重５０ｇ～１００ｇ。试验开始时每个性别动物体重的差异不应超过平均体重的±２０％。每组动物数不少于２０只，雌雄各半；若计划试验结束做恢复期的观察，应增加动物数（对照和高剂量增加卫星组，每组１０只，雌雄各半）。犬应选用４个月～６个月幼犬，试验开始时每个性别动物体重差异不应超过平均体重的±２０％，每组动物数不少于８只，雌雄各半；若计划试验结束做恢复期的观察，应增加动物数（对照和高剂量增加卫星组，每组４只，雌雄各半）。对照组动物性别和数量应与受试物组相同。
５．２．２　动物准备
试验前大鼠在实验动物房至少应进行３ｄ～５ｄ（犬７ｄ～１４ｄ）环境适应和检疫观察。
５．２．３　动物饲养
实验动物饲养条件应符合GB １４９２５、饮用水应符合GB ５７４９、饲料应符合GB １４９２４的有关规定。
试验期间动物自由饮水和摄食，推荐单笼饲养，大鼠也可按组分性别分笼群饲，每笼动物数（一般不超过３只）应满足实验动物最低需要的空间，以不影响动物自由活动和观察动物的体征为宜。试验期间每组动物非试验因素死亡率应小于１０％，濒死动物应尽可能进行血液生化指标检测、大体解剖以及病理组织学检查，每组生物标本损失率应小于１０％。
５．３　剂量
５．３．１　分组
试验至少设３个受试物剂量组，１个阴性（溶媒）对照组，必要时增设未处理对照组。若试验结束做恢复期观察，对照和高剂量需增设卫星组。对照组除不给受试物外，其余处理均同受试物剂量组。
５．３．２　剂量设计
５．３．２．１　原则上高剂量应使部分动物出现比较明显的毒性反应，但不引起死亡；低剂量不宜出现任何观察到毒效应（相当于ＮＯＡＥＬ），且高于人的实际接触水平；中剂量介于两者之间，可出现轻度的毒性效应，以得出ＬＯＡＥＬ。一般递减剂量的组间距以２倍～４倍为宜，如受试物剂量总跨度过大，可加设剂量组。试验剂量的设计参考急性毒性ＬＤ５０剂量和人体实际摄入量进行。
GB １５１９３．２２-２０１４
５．３．２．２　能求出ＬＤ５０的受试物，以ＬＤ５０的１０％～２５％作为２８天经口毒性试验的最高剂量组，此ＬＤ５０百分比的选择主要参考ＬＤ５０剂量-反应曲线的斜率。然后在此剂量下设几个剂量组，最低剂量组至少是人体预期摄入量的３倍。
５．３．２．３　求不出ＬＤ５０的受试物，试验剂量应尽可能涵盖人体预期摄入量１００倍的剂量，在不影响动物摄食及营养平衡前提下应尽量提高高剂量组的剂量。对于人体拟摄入量较大的受试物，高剂量组亦可以按最大给予量设计。
５．４　试验步骤和观察指标
５．４．１　受试物给予
５．４．１．１　根据受试物的特性和试验目的，选择受试物掺入饲料、饮水或灌胃方式给予。若受试物影响动物适口性，应灌胃给予。受试物应连续给予２８天。
５．４．１．２　受试物灌胃给予，要将受试物溶解或悬浮于合适的溶媒中，首选溶媒为水、不溶于水的受试物可使用植物油（如橄榄油、玉米油等），不溶于水或油的受试物亦可使用羧甲基纤维素、淀粉等配成混悬液或糊状物等。受试物应现用现配，有资料表明其溶液或混悬液储存稳定者除外。应每日在同一时段灌胃１次，每周称体重２次，根据体重调整灌胃体积。灌胃体积一般不超过１０ｍＬ／ｋｇ体重，如为水溶液时，最大灌胃体积大鼠可达２０ｍＬ／ｋｇ体重，犬１５ｍＬ／ｋｇ体重；如为油性液体，灌胃体积应不超过４ｍＬ／ｋｇ体重；各组灌胃体积一致。
５．４．１．３　受试物掺入饲料或饮水给予，要将受试物与饲料（或饮水）充分混匀并保证该受试物配制的稳定性和均一性，以不影响动物摄食、营养平衡和饮水量为原则，受试物掺入饲料比例一般小于质量分数５％，若超过５％时（最大不应超过１０％），调整对照组饲料营养素水平（若受试物无热量或营养成分，且添加比例大于５％时，对照组饲料应填充甲基纤维素等，掺入量等同高剂量），使其与受试物组饲料营养素水平保持一致，同时增设未处理对照组；亦可视受试物热量或营养成分的状况调整受试物剂量组饲料营养素水平，使其与对照组饲料营养素水平保持一致。受试物剂量单位是每千克体重所摄入受试物的
毫克（或克）数，即ｍｇ／ｋｇ体重（或ｇ／ｋｇ体重），当受试物掺入饲料其剂量单位亦可表示为 ｍｇ／ｋｇ（或ｇ／ｇ）饲料，掺入饮水则表示为ｍｇ／ｍＬ水。受试物掺入饲料时，需将受试物剂量（ｍｇ／ｋｇ体重）按动物每
１００ｇ体重的摄食量折算为受试物饲料浓度（ｍｇ／ｋｇ饲料），一般２８天经口毒性试验大鼠每日摄食量按体重１０％折算。
５．４．２　一般临床观察
观察期限为２８ｄ，若设恢复期观察，动物应停止给予受试物后继续观察１４ｄ，以观察受试物毒性的可逆性、持续性和迟发效应。试验期间至少每天观察一次动物的一般临床表现，并记录动物出现中毒的体征、程度和持续时间及死亡情况。观察内容包括被毛、皮肤、眼、黏膜、分泌物、排泄物、呼吸系统、神经系统、自主活动（如：流泪、竖毛反应、瞳孔大小、异常呼吸）及行为表现（如：步态、姿势、对处理的反应、有无强直性或阵挛性活动、刻板反应、反常行为等）。对体质弱的动物应隔离，濒死和死亡动物应及时解剖。
５．４．３　体重和摄食及饮水消耗量
每周记录体重、摄食量，计算食物利用率；试验结束时，计算动物体重增长量、总摄食量、总食物利用率。受试物经饮水给予，应每日记录饮水量。如受试物经掺入饲料或饮水给予，应计算和报告受试物各剂量组实际摄入剂量。
５．４．４　眼部检查
试验前和试验结束时，至少对高剂量组和对照组实验动物进行眼部（角膜、球结膜、虹膜）检查，犬用GB １５１９３．２２-２０１４
荧光素钠进行检查，若发现高剂量组动物有眼部变化，则应对所有动物进行检查。
５．４．５　血液学检查
大鼠试验结束、恢复期结束（卫星组）进行血液学指标测定；犬试验前、试验结束、恢复期结束（卫星组）进行血液学指标测定。推荐指标为白细胞计数及分类（至少三分类）、红细胞计数、血红蛋白浓度、红细胞压积、血小板计数、凝血酶原时间（ＰＴ）、活化部分凝血活酶时间（ＡＰＴＴ）等。如果对血液系统有影响，应加测网织红细胞、骨髓涂片细胞学检查。
５．４．６　血生化检查
大鼠试验结束、恢复期结束（卫星组）进行血液生化指标测定；犬试验前、试验结束、恢复期结束（卫星组）进行血液生化指标测定，应空腹采血。测定指标应包括电解质平衡、糖、脂和蛋白质代谢、肝（细胞、胆管）肾功能等方面。至少包含丙氨酸氨基转移酶（ＡＬＴ）、门冬氨酸氨基转移酶（ＡＳＴ）、谷氨酰转肽酶（ＧＧＴ）、碱性磷酸酶（ＡＫＰ）、尿素（Ｕｒｅａ）、肌酐（Ｃｒｅ）、血糖（Ｇｌｕ）、总蛋白（ＴＰ）、白蛋白（Ａｌｂ）、总胆固醇（ＴＣ）、甘油三酯（ＴＧ）、氯、钾、钠指标。必要时可检测钙、磷、尿酸（ＵＡ）、胆碱酯酶、山梨醇脱氢酶、总胆汁酸（ＴＢＡ）、高铁血红蛋白、激素等指标。应根据受试物的毒作用特点或构效关系增加检测内容。