葡萄细菌性疫病菌检疫鉴定方法
Detection and identification of Xylophilus ampelinus (Panagopoulos) Willems et al.
1 范围
本文件规定了葡萄细菌性疫病菌的分离培养、免疫学及分子生物学等检测鉴定方法。
本文件适用于葡萄及其繁殖材料中葡萄细菌性疫病菌的检疫和鉴定。
2 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文
件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
SN/T 2122 进出境植物及植物产品检疫抽样方法
3 术语和定义
本文件没有需要界定的术语和定义。
4 葡萄细菌性疫病菌分类信息
中文名:葡萄细菌性疫病菌、葡萄嗜木质菌
5 方法原理
根据葡萄细菌性疫病菌与抗体之间特异性反应,对待测物进行免疫学检测;根据葡萄细菌性疫病菌
的特异性DNA序列进行分子生物学检测;根据葡萄细菌性疫病菌的培养性状、生物学特性以及危害症状等对病原菌进行分离培养,必要时进行致病性检测。
6 试剂、材料和培养基
6.1 试剂和材料
除有说明外,所有试验用试剂均为分析纯或生化试剂。
试剂:75%酒精、葡萄糖、琼脂糖、无菌双蒸水、十二烷基硫酸钠(SDS)、三氯甲烷、异戊醇、苯酚、异丙醇、无水乙醇、蛋白酶K、核酸染料、DNA分子质量标准物、50×TAE电泳缓冲液。
试剂及其配制的信息见附录B。
材料:植物基因组提取试剂盒、细菌基因组提取试剂盒、普通PCR反应试剂盒、荧光PCR反应试剂盒等。
6.2 培养基
YPGA培养基、营养琼脂培养基(NA),培养基及其制备的信息见附录C。分离培养基推荐用YPGA,
也可用NA代替。
7 仪器和用具
7.1 仪器
生物显微镜(放大倍数400倍以上)、恒温培养箱、电子天平(千分之一)、植物光照培养箱、冰箱、离心机、酶标仪、电泳仪、PCR扩增仪、实时荧光定量PCR仪等。
7.2 用具
可调移液器(2.5μL,10μL,20μL,100μL,1000μL)、吸头、离心管等。
8 检疫鉴定方法
8.1 现场取样
参照附录A中的症状描述观察藤茎(图A.1)和叶片(图A.2)是否有葡萄细菌性疫病菌的典型症
状。对现场发现上述类似症状的植株进行取样。果实和植株取样方法按照SN/T 2122。
8.2 样品处理
实验室用水应满足GB/T 6682要求。根据后续试验的需求可选择无菌水或不同的抽提缓冲液并
做适当的稀释。
8.2.1 有症状植物材料
样品中包括多个植物组织或多个样品,应选择具有典型症状的植物组织分别分离病原菌。幼苗和
藤茎、叶片的分离如下:
a) 幼苗和藤茎:取葡萄幼苗或藤茎,将表皮或其他腐烂组织去除后,用无菌刀具取病健交界部位的
维管束组织0.5cm~1cm数段放入3mL~5mL无菌水或无菌磷酸盐缓冲液中静置10min~
15min得到抽提液。
也可取长约5cm的幼苗或藤茎用自来水冲洗后迅速浸入75%的酒精约1min,然后用无菌刀
具将两端部分及坏死的病变组织移除,再将剩余部分浸入75%的酒精后并使之燃烧(此部分
仅适用于病原菌的分离)。待幼苗上的酒精烧尽后放入无菌塑料袋中,无菌塑料袋中按
无菌水∶植物组织=6∶1比例加入无菌蒸馏水,并捶打挤压幼苗。将此抽提液室温下轻轻搅
动放置40min~60min,或5℃静置16h,1000g离心5min备用。
b) 叶片:用自来水清洗干净样品,再用75%的酒精表面消毒并迅速用无菌水漂洗。无菌刀具截
取病健交界部位的叶脉和叶柄捣碎后置于无菌水或无菌磷酸缓冲液中,静置10min~15min
得到抽提液。
从幼苗和藤茎、叶片中得到的抽提液应即提即用。长期保存需在抽提液中加入无菌甘油(分析纯),无菌甘油占总体积的20%~30%(体积分数),-20℃保存。
8.2.2 无症状植物材料
无症状植物材料按照随机抽取的原则,按照8.2.1中方法获取抽提液。
也可将藤茎切成1cm~2cm长的小段置于10mL~15mL无菌磷酸缓冲液中,或用50mL无菌
注射器吸取收集藤茎汁液约2mL置于无菌磷酸缓冲液中备用。
抽提液应即提即用。长期保存需在抽提液中加入无菌甘油(分析纯),无菌甘油占总体积的20%~
30%(体积分数),-20℃保存。
8.2.3 葡萄果实
葡萄果实用自来水冲洗后迅速浸入75%的酒精约1min,无菌操作去皮后置于无菌培养皿或无菌
均质袋中,捣碎或均质后取葡萄汁液作为抽提液备用。
抽提液应即提即用。长期保存需在抽提液中加入无菌甘油(分析纯),无菌甘油占总体积的20%~
30%(体积分数),-20℃保存。
8.3 免疫学检测
采用ELISA方法进行检测,按照说明书进行操作及结果判定。
8.4 分子生物学检测
8.4.1 模板制备
从8.2中得到的抽提液,按照附录D中的D.1提取总DNA作为分子生物学检测反应模板。对于
分离培养得到的疑似菌株,可直接作为分子生物学检测反应模板。根据实验室条件,可选择下列任一方法(8.4.2或8.4.3)进行检测。
8.4.2 普通PCR和巢式PCR
从抽提液或其他分离物中提取的DNA作为模板,进行普通PCR和巢式PCR检测。检测步骤和条
件按照D.2进行。
8.4.3 实时荧光PCR
从抽提液或其他分离物中提取的DNA作为模板,进行实时荧光PCR检测。检测步骤和条件按照
D.3进行。
8.5 病原菌分离
8.5.1 有症状植物材料
取8.2.1中得到的液体直接涂布于YPGA平板,每个样品涂布5个~10个平皿。25℃下培养,从
第三天起每天观察平板上菌落生长情况。典型菌落在培养基上生长慢,光滑不黏稠,有光泽,微凸,淡黄色,圆形,边缘整齐规则,培养7d~12d后大小约2mm。必要时可对菌落进行一次纯化培养。
8.5.2 无症状植物材料
取8.2.2中得到的液体1.0mL,用无菌水或磷酸缓冲液进行10倍、100倍、1000倍稀释,各取200μL稀释液用于YPGA平板涂布分离,每个稀释度涂布5个~10个平皿。培养方法同8.5.1。
8.6 致病性检测
必要时,可进行致病性测定。
致病性实验在盆栽易感菌葡萄藤茎或新扦插幼苗上进行。将在YPGA培养基上新鲜培养的疑似
菌收集后用无菌水制成约1×108CFU/mL的菌悬液,在幼苗藤茎上用无菌刀具切开2cm~4cm长并直达维管束深的新鲜伤口,将1滴~2滴菌悬液接种到伤口上,或叶片新鲜伤口上,用无菌水蘸湿的灭菌棉覆盖伤口并用锡箔纸包扎,5个~10个重复。同法用葡萄细菌性疫病菌标准菌株做阳性对照,用无菌水做阴性对照,至少2个重复。接种后的葡萄幼苗置于20℃~27℃,日照时间为14h~18h、水分肥料充足的环境中培养3周~4周。
致病性实验也可在试管内已生根的易感菌葡萄藤茎上进行,将在YPGA培养基上新鲜培养的疑似
菌收集后用无菌水制成约1×109CFU/mL的菌悬液,用无菌刀具将葡萄藤茎的最顶端切除后,将1滴菌悬液接种到伤口上,用无菌水蘸湿的灭菌棉覆盖伤口并用锡箔纸包扎,5个~10个重复。同法用葡萄细菌性疫病菌标准菌株做阳性对照,用无菌水做阴性对照,至少2个重复。接种后的葡萄幼苗置于20℃~27℃,日照时间为14h~18h潮湿的环境中培养3周~4周。
9 结果判定
9.1 有典型症状的植物组织
对样品抽提液或疑似菌株按照8.3和8.4进行检测,两种方法检测结果均为阳性的可判定为检出葡
萄细菌性疫病菌;两种方法检测结果均为阴性的可判定为未检出葡萄细菌性疫病菌;检测结果中只有一个结果为阳性的,进行病原菌分离,分离得到典型或疑似菌株,经8.3或8.4任一方法(与初筛检测出阳性结果不同的方法)进行检测,结果为阳性的即判定为检出葡萄细菌性疫病菌,未分离到典型或疑似菌株,或菌株鉴定结果为阴性的判定为未检出葡萄细菌性疫病菌。
9.2 无典型症状的植物组织
对样品抽提液采用8.3和8.4方法进行检测筛选,筛选结果有一个阳性结果或两个均为阳性结果,
进行病原菌分离,分离得到典型或疑似菌落按照8.3和8.4进行检测,必要时结合致病性实验结果,出现2个阳性结果则可判定检出葡萄细菌性疫病菌;两个均为阴性结果的可判定未检出葡萄细菌性疫病菌;结果有一个阳性的,可采用8.4中与检测出阳性结果不同的PCR方法或结合致病性实验进行进一步鉴定,进一步鉴定结果为阴性的可判定未检出葡萄细菌性疫病菌。
按8.3和8.4方法筛选结果均为阴性的可判定未检出葡萄细菌性疫病菌。未分离到典型或疑似菌
落的,可判定出未检出葡萄细菌性疫病菌。
10 样品保存
检出葡萄细菌性疫病菌的样品经登记和经手人签字后妥善保存6个月以上。保存期满后应经高压
灭菌后方可处理。
11 菌种保存
分离并最终鉴定为葡萄细菌性疫病菌的菌株转接到YPGA培养基试管斜面上,登记和经手人签字
后置于4℃冰箱中保存,30d转接一次。也可将菌株冻干保存。
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