GB 15193.4-2014

GB 15193.4-2014
(National food safety standard.Bacterial reverse mutation assay)
中华人民共和国国家标准
食品安全国家标准
细菌回复突变试验
2014-12-24发布
2015-05-01实施
中 华 人 民 共 和 国
国家卫生和计划生育委员会 发 布
前言
本标准代替GB 15193.4-2003《鼠伤寒沙门氏菌/哺乳动物微粒体酶试验》。
本标准与GB 15193.4-2003相比,主要变化如下:
---标准名称修改为“食品安全国家标准 细菌回复突变试验”;
---修改了范围;
---增加了术语和定义;
---修改了试验目的和原理;
---修改了仪器;
---修改了磷酸盐贮备液的配制方法;
---修改了组氨酸-生物素溶液的配制方法;
---修改了对DMSO的要求;
---修改了辅酶-Ⅱ和葡萄糖-6-磷酸钠盐溶液的配制要求;
---修改了进行菌株基因型鉴定的条件;
---修改了对增菌培养的要求;
---修改了受试物的特殊处理;
---修改了选择溶媒的要求;
---修改了剂量设计的内容;
---修改了试验菌株;
---修改了试验方法中对观察结果所需时间的规定;
---修改了对照组的设置;
---增加了制备S9的方法、生物素缺陷型菌株的鉴定、结果判定的内容、试验报告的要求、试验的解释;
---修改了附录。
食品安全国家标准
细菌回复突变试验
1 范围
细菌回复突变试验包括鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验和大肠杆菌细菌回复突变试验。本标准规定了鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验的基本技术要求,选择大肠杆菌进行细菌回复突变试验时应参阅有关文献。
本标准适用于评价受试物的致突变作用。
2 术语和定义
2.1 细菌回复突变试验
以营养缺陷型的突变体菌株为指示生物检测基因突变的体外试验。常用的菌株有组氨酸营养缺陷型鼠伤寒沙门氏菌和色氨酸营养缺陷型的大肠杆菌。
2.2 碱基取代型基因突变
DNA多核苷酸链上某个碱基为另一个碱基取代,引起DNA碱基序列异常。
2.3 移码型基因突变
在DNA碱基序列中插入或缺失了一个或几个(除了3和3的倍数)碱基,按三联密码连续阅读的
规则,该部位以后的密码子组成全部改变,指导合成的多肽链也全部发生改变。
3 试验目的和原理
检测受试物对微生物(细菌)的基因突变作用,预测其遗传毒性和潜在的致癌作用。
细菌回复突变试验利用鼠伤寒沙门氏菌和大肠杆菌来检测点突变,涉及DNA的一个或几个碱基
对的置换、插入或缺失见附录A。鼠伤寒沙门氏菌和大肠杆菌的试验菌株分别为组氨酸缺陷突变型和色氨酸缺陷突变型,在无组氨酸或色氨酸的培养基上不能生长,在有组氨酸或色氨酸的培养基上才能正常生长。致突变物存在时可以回复突变为原养型,在无组氨酸或色氨酸的培养基上也可以生长。故可根据菌落形成数量来衡量受试物是否为致突变物。
某些致突变物需要代谢活化后才能使上述细菌产生回复突变,受试物要同时在有和没有代谢活化系统的条件下进行试验。
4 仪器和试剂
4.1 仪器
实验室常用设备、低温高速离心机、低温冰箱(-80℃)或液氮罐、生物安全柜、恒温培养箱、恒温水浴、灭菌设备、匀浆器等。
4.2 试剂
4.2.1 营养肉汤培养基
牛肉膏 2.5g
胰蛋白胨 5.0g
氯化钠 2.5g
磷酸氢二钾(K2HPO4·3H2O) 1.3g
加蒸馏水至500mL,加热溶解,调pH至7.4,分装后0.103MPa灭菌20min,4℃保存备用,保存
期不超过半年。
4.2.2 营养肉汤琼脂培养基
琼脂粉 1.5g
加营养肉汤培养基至100mL,加热融化后调节pH为7.4,0.103MPa灭菌20min。
4.2.3 底层培养基
4.2.3.1 配制方法
在400mL灭菌的1.5%琼脂培养基(100℃)中依次加入磷酸盐贮备液8mL,40%葡萄糖溶液
20mL,充分混匀,冷却至80℃左右时按每平皿25mL(相对于90mm平皿)制备平板,冷凝固化后倒
置于37℃培养箱中24h,备用。
4.2.3.2 磷酸盐贮备液(Vogel-BonnerminimalmediumE,50倍)
磷酸氢钠铵(NaNH4HPO4·4H2O) 17.5g
柠檬酸(C6H8O7·H2O) 10.0g
磷酸氢二钾(K2HPO4) 50.0g
硫酸镁(MgSO4·7H2O) 1.0g
加蒸馏水至100mL溶解,0.103MPa灭菌20min。
注:待其他试剂完全溶解后再将硫酸镁缓慢放入其中继续溶解,否则容易析出沉淀。
4.2.3.3 40%葡萄糖溶液
葡萄糖40.0g加蒸馏水至100mL,0.055MPa灭菌20min。
4.2.3.4 1.5%琼脂培养基
琼脂粉6.0g加入400mL锥形瓶,加蒸馏水至400mL,融化后,0.103MPa灭菌20min。
4.2.4 顶层培养基
加热融化顶层琼脂,每100mL顶层琼脂中加10mL组氨酸-生物素溶液(0.5mmol/L)。混匀,分
装在4个烧瓶中,0.103MPa灭菌20min。用时融化分装小试管,每管2mL,45℃水浴中保温。顶层
琼脂和组氨酸-生物素溶液(0.5mmol/L)配制如下。
4.2.4.1 顶层琼脂
琼脂粉3.0g,氯化钠2.5g加蒸馏水至500mL,0.103MPa灭菌20min。
4.2.4.2 组氨酸-生物素溶液(0.5mmol/L)(诱变试验用)
D-生物素(相对分子质量244)30.5mg和L-组氨酸(相对分子质量155)19.4mg加蒸馏水至
250mL,0.103MPa灭菌20min。
4.2.5 特殊试剂及培养基
4.2.5.1 0.8%氨苄青霉素溶液(鉴定菌株用,无菌配制)
氨苄青霉素40mg用氢氧化钠溶液(0.02mol/L)稀释至5mL,保存4℃冰箱备用。
4.2.5.2 0.1%结晶紫溶液(鉴定菌株用)
100mg结晶紫,溶于无菌水至100mL。
4.2.5.3 L-组氨酸溶液和D-生物素溶液(0.5mmol/L)(鉴定菌株用)
L-组氨酸0.4043g和D-生物素12.2mg分别溶于蒸馏水至100mL,0.103MPa灭菌20min,保存
于4℃冰箱备用。
4.2.5.4 0.8%四环素溶液(用于四环素抗性试验和氨苄青霉素-四环素平板)
40mg四环素用盐酸缓冲液(0.02mol/L)稀释至5mL,保存于4℃冰箱。
4.2.5.5 氨苄青霉素平板(用作TA97、TA98、TA100菌株的主平板)和氨苄青霉素-四环素平板(用作TA102菌株的主平板)
每1000mL由以下成分组成:
底层培养基 980mL
组氨酸水溶液(0.4043g/100mL) 10mL
生物素(0.5mmol/L) 6mL
0.8%氨苄青霉素溶液 3.15mL
0.8%四环素溶液 0.25mL
四环素仅在使用对四环素有抗性的TA102时加入。各成分均已分别灭菌或无菌制备。
4.2.5.6 组氨酸-生物素平板(组氨酸需要试验用)
每1000mL中由以下成分组成:
底层培养基 984mL
组氨酸水溶液(0.4043g/100mL) 10mL
生物素(0.5mmol/L) 6mL
各成分均已分别灭菌。
4.2.5.7 二甲亚砜(DMSO)
光谱纯,无菌。
4.2.6 阳性诱变剂的配制
根据所选择的诱变剂的种类和剂量用适当的溶媒配制阳性对照品(见附录B、附录C)。
注:培养基成分或试剂除特殊说明外至少应是化学纯,无诱变性。避免重复高温处理,选择适当保存温度和期限。
4.3 10%S9混合液的制备
4.3.1 S9辅助因子的配制
4.3.1.1 镁钾溶液
氯化镁1.9g和氯化钾6.15g加蒸馏水溶解至100mL。
4.3.1.2 磷酸盐缓冲液(0.2mol/L)(pH7.4)
磷酸氢二钠(Na2HPO4,28.4g/L) 440mL
磷酸二氢钠(NaH2PO4·H2O,27.6g/L) 60mL
调pH至7.4,0.103MPa灭菌20min或滤菌。
4.3.1.3 辅酶-Ⅱ(氧化型)溶液
无菌条件下称取辅酶-Ⅱ,用无菌蒸馏水溶解配制成溶液(0.025mol/L),现用现配。
4.3.1.4 葡萄糖-6-磷酸钠盐溶液
无菌条件下称取葡萄糖-6-磷酸钠盐,用无菌蒸馏水溶解配制成溶液(0.05mol/L),现用现配。
4.3.2 大鼠肝S9组分的诱导和配制
选健康雄性成年 SD 或 Wistar大鼠,体重150g~200g,周龄约5周~6周。将多氯联苯
(Aroclor1254)溶于玉米油中,浓度为200g/L,按500mg/kg体重无菌操作一次腹腔注射,5d后处死
动物,处死前禁食12h。
也可采用苯巴比妥钠和β-萘黄酮联合诱导的方法进行制备,经口灌胃给予大鼠苯巴比妥钠和β-萘黄酮,剂量均为80mg/kg,连续3d,禁食16h后断头处死动物。其他操作同多氯联苯诱导。
处死动物后取出肝脏,称重后用新鲜冰冷的氯化钾溶液(0.15mol/L)连续冲洗肝脏数次,以
便除去能抑制微粒体酶活性的血红蛋白。每克肝(湿重)加氯化钾溶液(0.1mol/L)3mL,连同烧杯
移入冰浴中,用无菌剪刀剪碎肝脏,在玻璃匀浆器(低于4000r/min,1min~2min)或组织匀浆器(低
于20000r/min,1min)中制成肝匀浆。以上操作需注意无菌和局部冷环境。
将制成的肝匀浆在低温(0℃~4℃)高速离心机上以9000g离心10min,吸出上清液为S9组分,
分装于无菌冷冻管或安瓿中,每安瓿2mL左右,用液氮或干冰速冻后置80℃低温保存。
S9组分制成后,经无菌检查,测定蛋白含量(Lowry法),每毫升蛋白含量不超过40mg为宜,并经
间接致癌物(诱变剂)鉴定其生物活性合格后贮存于深低温或冰冻干燥,保存期不超过1年。
4.3.3 10%S9混合液的制备10%S9混合液一般由S9组分和辅助因子按1∶9组成,也可将浓度配制成30%(不同受试物所需S9浓度不同),临用时新鲜无菌配制,或过滤除菌。10%S9混合液10mL配制如下:
磷酸盐缓冲液 6.0mL
镁钾溶液 0.4mL
葡萄糖-6-磷酸钠盐溶液 1.0mL
辅酶-Ⅱ溶液 1.6mL
肝S9组分 1.0mL
混匀,置冰浴中待用。
用每平板0.5mLS9混合液(含20μL~50μLS9)测定其对已知阳性致癌物(诱变剂)的生物活性,
确定最适用量。也可按一般用量,即每平皿0.5mLS9混合液。
5 菌株及其鉴定与保存
5.1 试验菌株
推荐采用下列的菌株组合:
a) 鼠伤寒沙门氏菌TA1535;
b) 鼠伤寒沙门氏菌TA97a或TA97或TA1537;
c) 鼠伤寒沙门氏菌TA98;
d) 鼠伤寒沙门氏菌TA100;
e) 鼠伤寒沙门氏菌TA102或大肠杆菌 WP2uvrA或大肠杆菌 WP2uvrA(PKM101)。
5.2 菌株的鉴定
5.2.1 总则
菌株特性应与回复突变试验标准相符。菌株的鉴定包括:基因型鉴定、自发回变数鉴定和对阳性致突变物敏感性的鉴定。
每3个月进行一次菌株鉴定,遇到下列情况也应进行菌株鉴定:
a) 在收到培养菌株后;
b) 当制备一套新的冷冻保存或冰冻干燥菌株时;
c) 重新挑选菌株时;
d) 使用主平板传代时。
5.2.2 鉴定方法
5.2.2.1 增菌培养
在5mL营养肉汤培养基中用接种环接种贮存菌培养物,37℃振荡(100次/min)培养10h或静置
培养16h,使活菌数不少于1×109/mL~2×109/mL。
5.2.2.2 组氨酸缺陷型(his)的鉴定
5.2.2.2.1 底层培养皿的制备
加热融化底层培养基两瓶。一瓶不加组氨酸,每100mL底层培养基中加0.5mmolD-生物素
0.6mL;另一瓶加组氨酸,每100mL底层培养基中加L-组氨酸1mL和0.5mmolD-生物素0.6mL。
冷却至50℃左右,每种底层培养基各倒两个平板。
5.2.2.2.2 接种
取有组氨酸和无组氨酸培养基平板各一个,按菌株号顺序各取一接种环的菌液划直线于培养基表面,37℃培养48h。