GB 15193.3-2014

GB 15193.3-2014
National Food Safety Standard.Acute toxicity test
中华人民共和国国家标准
食品安全国家标准
急性经口毒性试验
2014-12-24发布
2015-05-01实施
中 华 人 民 共 和 国
国家卫生和计划生育委员会 发 布
前言
本标准代替GB 15193.3-2003《急性毒性试验》。
本标准与GB 15193.3-2003相比,主要变化如下:
---标准名称修改为“食品安全国家标准 急性经口毒性试验”;
---修改了范围;
---增加了试验报告和试验的解释;
---修改了实验动物和试验方法;
---删除了最大耐受剂量法,增加了限量法和上-下法;
---修改了附录。
食品安全国家标准
急性经口毒性试验
1 范围
本标准规定了急性经口毒性试验的基本试验方法和技术要求。
本标准适用于评价受试物的急性经口毒性作用。
2 术语和定义
2.1 急性经口毒性
一次或在24h内多次经口给予实验动物受试物后,动物在短期内出现的毒性效应。
2.2 半数致死量(LD50)
经口一次或24h内多次给予受试物后,能够引起动物死亡率为50%的受试物剂量,该剂量为经过统计得出的计算值。其单位是每千克体重所摄入受试物质的毫克数或克数,即mg/kg体重或g/kg体重。
3 试验目的和原理
急性经口毒性试验是检测和评价受试物毒性作用最基本的一项试验,即经口一次性或24h内多次
给予受试物后,在短期内观察动物所产生的毒性反应,包括中毒体征和死亡,通常用LD50来表示。
该试验可提供在短期内经口接触受试物所产生的健康危害信息;作为急性毒性分级的依据;为进一步毒性试验提供剂量选择和观察指标的依据;初步估测毒作用的靶器官和可能的毒作用机制。
4 试验方法
4.1 受试物
4.1.1 受试物的配制
应将受试物溶解或悬浮于合适的溶媒中,首选溶媒为水,不溶于水的受试物可使用植物油(如橄榄油、玉米油等),不溶于水或油的受试物亦可使用羧甲基纤维素、淀粉等配成混悬液或糊状物等。受试物应新鲜配制,有资料表明其溶液或混悬液储存稳定者除外。
4.1.2 受试物的给予
4.1.2.1 途径
经口灌胃。
4.1.2.2 试验前禁食
试验前动物需禁食,一般大鼠需整夜禁食(一般禁食16h左右),小鼠需禁食4h~6h,自由饮水。
给予受试物后大鼠需继续禁食3h~4h,小鼠需继续禁食1h~2h。若采用分批多次给予受试物,可根
据染毒间隔时间的长短给动物一定量的饲料。
4.1.2.3 灌胃体积
各受试物组的灌胃体积应相同,大鼠为10mL/kg体重,小鼠为20mL/kg体重。如果溶媒为水,
大鼠最大灌胃体积可达20mL/kg体重,小鼠可达40mL/kg体重。
4.1.2.4 方式
一般一次性给予受试物。也可一日内多次给予(每次间隔4h~6h,24h内不超过3次,尽可能达
到最大剂量,合并作为一次剂量计算)。
4.1.2.5 观察期限
一般观察14d,必要时延长到28d,特殊应急情况下至少观察7d。
4.2 实验动物
4.2.1 动物选择
实验动物的选择应符合国家标准和有关规定(GB 14923、GB 14922.1、GB 14922.2)。选择两种性别的健康成年大鼠(180g~220g)和(或)小鼠(18g~22g),或选用其他实验动物。雌性动物应是未交配过、未妊娠的。同性别实验动物个体间体重相差不超过平均体重的±20%。
4.2.2 动物准备
试验前实验动物在试验环境中至少应进行3d~5d环境适应和检疫观察。
4.2.3 动物饲养
实验动物饲养条件、饮用水、饲料应符合国家标准和有关规定(GB 14925、GB 5749、GB 14924.1、GB 14924.2、GB 14924.3)。每个受试物组动物按性别分笼饲养。每笼动物数以不影响动物自由活动和观察动物的体征为宜。对某些受试物常引起的特殊生物学特性及毒性反应(如易激动、互斗相残等)可作单笼饲养。试验期间实验动物喂饲基础饲料,自由饮水。
4.3 几种常用的急性毒性试验设计方法
4.3.1 霍恩氏(Horn)法
4.3.1.1 预试验
根据受试物的性质和已知资料,选用下述方法:一般多采用100mg/kg体重,1000mg/kg体重和
10000mg/kg体重的剂量,各以2只~3只动物预试。根据24h内死亡情况,估计LD50的可能范围,确
定正式试验的剂量组。也可简单地直接采用一个剂量,如215mg/kg体重,用5只动物预试。观察2h内动物的中毒表现。如中毒体征严重,估计多数动物可能死亡,即可采用低于215mg/kg体重的剂量系列进入正式试验;反之中毒体征较轻,则可采用高于此剂量的剂量系列。如有相应的文献资料时可不进行预试。
4.3.1.2 正式试验
4.3.1.2.1 动物数
一般每组10只动物,雌雄各半。
4.3.1.2.2 常用剂量系列
1.00
2.15
4.64
ïï
ïï
×10t t=0,±1,±2,±3
1.00
3.16}×10t t=0,±1,±2,±3
因为剂量间距较1.00
3.16}×10t t=0,±1,±2,±3为小,所以结果较为精确。一般试验时,可根据上
述剂量系列设计5个组,即较原来的方法在最低剂量组以下或最高剂量组以上各增设一组,这样在查表时容易得出结果。
4.3.1.2.3 观察
观察期内记录动物死亡数、死亡时间及中毒表现等,根据每组死亡动物数和所采用的剂量系列,查表求得LD50(见附录A)。
4.3.2 限量法(limittest)
4.3.2.1 适用范围
该方法适用于有关资料显示毒性极小的或未显示毒性的受试物,给予动物一定剂量的受试物,仍不出现死亡。
4.3.2.2 动物数
一般选20只动物,雌雄各半。
4.3.2.3 剂量
一般选用剂量至少应为10.0g/kg体重,如剂量达不到10.0g/kg体重,则给予动物最大剂量(最大
使用浓度和最大灌胃体积)。
4.3.2.4 观察
给予受试物后,观察期内无动物死亡,则认为受试物对某种动物的经口急性毒性耐受剂量大于某一数值,其LD50大于该数值。如果动物出现死亡应选择其他方法。
4.3.3 上-下法(up-downprocedure,UDP)
4.3.3.1 适用范围
该方法主要适用于纯度较高、毒性较大、摄入量小且在给予受试物后动物1d~2d内死亡的受试
物,对预期给予受试物后动物在5d及以后死亡的受试物不适用。可按照试验者选择的剂量序列或在专用软件包指导下进行试验,并对试验结果进行统计。
4.3.3.2 上-下法限量试验
以2000mg/kg体重剂量先给1只动物受试物,如果动物在48h内死亡,应进行正式试验。如果
动物在48h内存活,另取4只动物以相同的剂量给予受试物,如5只动物中有3只死亡,应进行正式试
验;如3只及以上的动物存活,结束试验,则该受试物LD50>2000mg/kg体重。
如需要采用5000mg/kg体重剂量时,给1只动物受试物,如动物在48h内死亡,应进行正式试
验。如在48h内动物存活,另取2只动物,仍以相同剂量给予受试物,如在14d的观察期内动物全部存活,结束试验,则该受试物LD50>5000mg/kg体重;如果14d的观察期内后2只动物中有1只或2只
死亡,再追加2只动物,给予受试物后在14d观察期内5只动物中3只及以上动物存活,结束试验,该
受试物LD50>5000mg/kg;如5只动物中3只及以上动物分别在14d观察期内死亡,应进行正式
试验。
4.3.3.3 正式试验
4.3.3.3.1 动物数
单一性别,实验动物数一般为6只~9只。
4.3.3.3.2 剂量
选择起始剂量和剂量梯度系数时,如果没有受试物 LD50的估计值资料,默认的起始剂量为
175mg/kg体重;如果没有受试物的剂量-反应曲线斜率的资料,默认的剂量梯度系数为3.2(是斜率为2时的梯度系数),所设定的剂量系列为1.75mg/kg体重、5.5mg/kg体重、17.5mg/kg体重、55mg/kg体重、175mg/kg体重、555mg/kg体重、2000mg/kg体重或1.75mg/kg体重、5.5mg/kg体重、17.5mg/kg体重、55mg/kg体重、175mg/kg体重、555mg/kg体重、1750mg/kg体重、5000mg/kg体重。对于剂量-反应曲线斜率比较平缓或较陡的受试物,剂量梯度系数可加大或缩小,起始剂量可作适当调整。附录B列出了斜率为1~8的剂量梯度。
4.3.3.3.3 方法
试验开始时称量禁食后动物的体重,计算灌胃体积。经口灌胃,一次一只动物,每只动物的灌胃间
隔时间为48h。第二只动物的剂量取决于第一只动物的毒性结果,如动物呈濒死状态或死亡,剂量就下调一级;如动物存活,剂量就上调一级。
4.3.3.3.4 终止试验的规定
是否继续给予受试物取决于固定的时间间隔期内所有动物的生存状态,首次达到以下任何一种情况时,即可终止试验:
a) 在较高剂量给予受试物中连续有3只动物存活;
b) 连续6只动物给予受试物后出现5个相反结果;
c) 在第一次出现相反结果后,继续给予受试物至少4只动物,并且从第一次出现相反结果后计算
每一个剂量的似然值,其给定的似然比超过临界值。
依照试验结束时的动物生存状态即可计算受试物的LD50。附录C描述了正式试验LD50估计值和可信限的计算方法及特殊情况的处理方法。
如果给予受试物后动物在试验的后期才死亡,而较该剂量还高的动物仍处于存活状态,应当暂时停止继续给予受试物,观察其他动物是否也出现延迟死亡。当所有已经给予受试物的动物其结局明确后再继续染毒。如果后面的动物也出现延迟死亡,表示所有染毒的剂量水平都超过了LD50,应当选择更适当的、低于已经死亡的最低剂量的两个剂量级重新开始试验,并要延长观察期限。统计时延迟死亡的动物按死亡来计算。