GB 15193.26-2015

GB 15193.26-2015
(National Food Safety Standard chronic toxicity test)
中华人民共和国国家标准
食品安全国家标准
慢性毒性试验
2015-08-07发布
2015-10-07实施
中 华 人 民 共 和 国
国家卫生和计划生育委员会 发 布
食品安全国家标准
慢性毒性试验
1 范围
本标准规定了慢性毒性试验的基本试验方法和技术要求。
本标准适用于评价受试物的慢性毒性作用。
2 术语和定义
2.1 慢性毒性
实验动物经长期重复给予受试物所引起的毒性作用。
2.2 未观察到有害作用剂量
通过动物试验,以现有的技术手段和检测指标未观察到任何与受试物有关的毒性作用的最大剂量。
2.3 最小观察到有害作用剂量
在规定的条件下,受试物引起实验动物组织形态、功能、生长发育等有害效应的最小作用剂量。
2.4 靶器官
实验动物出现由受试物引起明显毒性作用的器官。
2.5 卫星组
毒性研究设计和实施中外加的动物组,其处理和饲养条件与主要研究的动物相似,用于试验中期或试验结束恢复期观察和检测,也可用于不包括在主要研究内的其他指标及参数的观察和检测。
3 试验目的和原理
确定实验动物长期经口重复给予受试物引起的慢性毒性效应,了解受试物剂量-反应关系和毒性作用靶器官,确定未观察到有害作用剂量(NOAEL)和最小观察到有害作用剂量(LOAEL),为预测人群接触该受试物的慢性毒性作用及确定健康指导值提供依据。
4 仪器和试剂
4.1 仪器与器械
实验室常用解剖器械、动物天平、电子天平、生物显微镜、生化分析仪、血细胞分析仪、血液凝固分析仪、尿液分析仪、离心机、切片机等。
4.2 试剂
甲醛、二甲苯、乙醇、苏木素、伊红、石蜡、血球稀释液、生化试剂、血凝分析试剂、尿分析试剂等。
5 试验方法
5.1 受试物
受试物应使用原始样品,若不能使用原始样品,应按照受试物处理原则对受试物进行适当处理。将受试物掺入饲料、饮用水或灌胃给予。
5.2 实验动物
5.2.1 动物选择
实验动物的选择应符合国家标准和有关规定(GB 14923、GB 14922.1、GB 14922.2)。啮齿类动物首选大鼠,非啮齿类动物首选犬。大鼠推荐周龄6周~8周,试验开始时每个性别动物体重差异不应超过平均体重的±20%。每组动物数至少40只,雌雄各半,雌鼠应为非经产鼠、非孕鼠。若计划试验中期剖检或试验结束做恢复期的观察(卫星组),应增加动物数(中期剖检每组至少20只,雌雄各半;卫星组通常仅增加对照组和高剂量组,每组至少20只,雌雄各半)。犬应选用月龄不超过9个月的幼犬(通常月龄选用4个月~6个月),试验开始时每个性别动物体重差异不应超过平均体重的±20%,每组动物数 至少8只,雌雄各半,雌犬应为非经产犬、非孕犬。若计划试验中期剖检或试验结束做恢复期的观察,应增加动物数(对照组和高剂量组各增加4只,雌雄各半)。对照组动物性别和数量应与受试物组相同。
5.2.2 动物准备
试验前动物在实验动物房至少应进行3d~5d(犬7d~14d)的环境适应和检疫观察。
5.2.3 动物饲养
实验动物饲养条件、饮用水、饲料应符合国家标准和有关规定(GB 14925、GB 5749、GB 14924.1、GB 14924.2、GB 14924.3)。试验期间动物自由饮水和摄食,可按组分性别分笼群饲,每笼动物数(一般大鼠不超过3只)应满足实验动物最低需要的空间,以不影响动物自由活动和观察动物的体征为宜。试验期间每组动物非试验因素死亡率应小于10%,濒死动物应尽可能进行血液生化指标检测、大体解剖以及病理组织学检查,每组生物标本损失率应小于10%。
5.3 剂量及分组
5.3.1 试验至少设3个受试物组,1个阴性(溶媒)对照组,对照组除不给予受试物外,其余处理均同受
试物组。必要时增设未处理对照组。
5.3.2 高剂量应根据90天经口毒性试验确定,原则上应使动物出现比较明显的毒性反应,但不引起过高死亡率;低剂量不引起任何毒性作用;中剂量应介于高剂量与低剂量之间,可引起轻度的毒性作用,以得出剂量-反应关系、NOAEL和(或)LOAEL。一般剂量的组间距以2倍~4倍为宜,不超过10倍。
5.4 试验期限
试验期限至少12个月。卫星组监测由受试物引起的任何毒性改变的可逆性、持续性或延迟性作用,停止给受试物后观察期限不少于28d,不多于试验期限的1/3。
5.5 试验步骤和观察指标
5.5.1 受试物给予
5.5.1.1 根据受试物的特性和试验目的,选择受试物掺入饲料、饮水或灌胃方式给予。若受试物影响动物适口性,应灌胃给予。
5.5.1.2 受试物灌胃给予,要将受试物溶解或悬浮于合适的溶媒中,首选溶媒为水,不溶于水的受试物可使用植物油(如橄榄油、玉米油等),不溶于水或油的受试物可使用羧甲基纤维素、淀粉等配成混悬液或糊状物等。受试物应现用现配,有资料表明其溶液或混悬液储存稳定者除外。同时应考虑使用的溶媒可能对受试物被机体吸收、分布、代谢和蓄积的影响;对受试物理化性质的影响及由此而引起的毒性特征的影响;对动物摄食量或饮水量或营养状况的影响。为保证受试物在动物体内浓度的稳定性,每日同一时段灌胃1次(每周灌胃6d),试验期间,前4周每周称体重两次,第5周~第13周每周称体重
1次,之后每4周称体重1次,按体重调整灌胃体积。啮齿类动物灌胃体积一般不超过10mL/kg体重,犬15mL/kg体重;如为油性液体,灌胃体积应不超过4mL/kg体重。各组灌胃体积一致。
5.5.1.3 受试物掺入饲料或饮水给予,要将受试物与饲料(或饮水)充分混匀并保证该受试物配制的稳定性和均一性,以不影响动物摄食、营养平衡和饮水量为原则。饲料中加入受试物的量很少时,宜先将受试物加入少量饲料中充分混匀后,再加入一定量饲料后再混匀,如此反复3次~4次。受试物掺入饲料比例一般小于质量分数5%,若超过5%时(最大不应超过10%),可调整对照组饲料营养素水平(若受试物无热量或营养成分,且添加比例大于5%时,对照组饲料应填充甲基纤维素等,掺入量等同高剂量),使其与受试物各剂量组饲料营养素水平保持一致,同时增设未处理对照组;亦可视受试物热量或营养成分的状况调整剂量组饲料营养素水平,使其与对照组饲料营养素水平保持一致。受试物剂量单位是每千克体重所摄入受试物的毫克(或克)数,即 mg/kg体重(或g/kg体重),当受试物掺入饲料,其剂 量单位亦可表示为 mg/kg(或g/kg)饲料,掺入饮水则表示为 mg/mL水。受试物掺入饲料时,需将受试物剂量(mg/kg体重)按动物每100g体重的摄食量折算为受试物饲料浓度(mg/kg饲料)。
5.5.2 一般观察
5.5.2.1 试验期间至少每天观察1次动物的一般临床表现,并记录动物出现中毒的体征、程度和持续时间及死亡情况。观察内容包括被毛、皮肤、眼、黏膜、分泌物、排泄物、呼吸系统、神经系统、自主活动(如:流泪、竖毛反应、瞳孔大小、异常呼吸)及行为表现(如步态、姿势、对处理的反应、有无强直性或阵挛性活动、刻板反应、反常行为等)。
5.5.2.2 如有肿瘤发生,记录肿瘤发生时间、发生部位、大小、形状和发展等情况。
5.5.2.3 对濒死和死亡动物应及时解剖并尽量准确记录死亡时间。
5.5.3 体重、摄食量及饮水量
试验期间前13周每周记录动物体重、摄食量和饮水量(当受试物经饮水给予时),之后每4周1次;
选择犬进行试验时应每周记录体重、摄食量和饮水量(当受试物经饮水给予时)。试验结束时,计算动物体重增长量、总摄食量、食物利用率(前3个月,啮齿类动物)、总食物利用率(非啮齿类动物)、受试物总摄入量。
5.5.4 眼部检查
试验前,对动物进行眼部检查(角膜、球结膜、虹膜)。试验结束时,对高剂量组和对照组动物进行眼部检查,若发现高剂量组动物有眼部变化,则应对其他组动物进行检查。
5.5.5 血液学检查
5.5.5.1 试验第3个月、第6个月和第12个月及试验结束时(试验期限为12个月以上时),每组至少检查雌雄各10只动物,每次检查应尽可能使用同一动物;选择犬进行试验时,增加试验第9个月这个时间点。如果90天经口毒性试验的剂量水平相当且未见任何血液学指标改变,则试验第3个月可不检查。
5.5.5.2 检查指标为白细胞计数及分类(至少三分类)、红细胞计数、血小板计数、血红蛋白浓度、红细胞压积、红细胞平均容积(MCV)、红细胞平均血红蛋白量(MCH)、红细胞平均血红蛋白浓度(MCHC)、凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)等。如果对造血系统有影响,应加测网织红细胞计数和骨髓涂片细胞学检查。
5.5.6 血生化检查
5.5.6.1 按5.5.5.1规定的时间和动物数进行。如果90天经口毒性试验的剂量水平相当且未见任何血生化指标改变,则试验第3个月可不检查。采血前宜将动物禁食过夜。
5.5.6.2 检查指标包括电解质平衡、糖、脂和蛋白质代谢、肝(细胞、胆管)肾功能等方面。至少包含丙氨酸氨基转移酶(ALT)、门冬氨酸氨基转移酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、谷氨酰转肽酶(GGT)、尿素(Urea)、肌酐(Cr)、血糖(Glu)、总蛋白(TP)、白蛋白(Alb)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、钙、氯、钾、钠、总胆红素等,必要时可检测磷、尿酸(UA)、总胆汁酸(TBA)、球蛋白、胆碱酯酶、山梨醇脱氢酶、高铁血红蛋白、特定激素等指标。
5.5.7 尿液检查
5.5.7.1 试验第3个月、第6个月和第12个月及试验结束时(试验期限为12个月以上时)对所有动物
进行尿液检查;选择犬进行试验时,增加试验第9个月这个时间点。如果90天经口毒性试验的剂量水平相当且未见任何尿液检查结果异常,则试验第3个月可不检查。
5.5.7.2 检查项目包括外观、尿蛋白、相对密度、pH、葡萄糖和潜血等,若预期有毒反应指征,应增加尿液检查的有关项目如尿沉渣镜检、细胞分析等。
5.5.8 体温、心电图检查犬试验前、试验第3个月、第6个月和第12个月及试验结束时(试验期限为12个月以上时)应进行 体温、心电图检查。