GB 15193.23-2014

GB 15193.23-2014
(National Food Safety Standard in vitro mammalian chromosome aberration test)
书中华人民共和国国家标准
GB １５１９３．２３-２０１４
食品安全国家标准
体外哺乳类细胞染色体畸变试验
（报批稿）
２０１４-１２-０１发布
２０１５-０５-０１实施
中 华 人 民 共 和 国
国家卫生和计划生育委员会 发 布
书食品安全国家标准
体外哺乳类细胞染色体畸变试验
１　范围
本标准规定了体外哺乳类细胞染色体畸变试验的基本试验方法和技术要求。
本标准适用于评价受试物的体外哺乳类细胞染色体畸变。
２　术语和定义
２．１　染色体结构畸变
通过显微镜可以直接观察到的发生在细胞有丝分裂中期的染色体结构变化。如染色体中间缺失和断片、染色体互换等。染色体结构畸变可分为染色体型畸变（ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ-ｔｙｐｅａｂｅｒｒａｔｉｏｎ）和染色单体型畸变（ｃｈｒｏｍａｔｉｄ-ｔｙｐｅａｂｅｒｒａｔｉｏｎ）。
２．１．１　染色体型畸变
染色体结构损伤，表现为在两个染色单体的相同位点均出现断裂或断裂重组等改变。
２．１．２　染色单体型畸变
染色体结构损伤，表现为染色单体断裂或染色单体断裂重组等改变。
２．２　有丝分裂指数
中期相细胞数与所观察的细胞总数之比值；是反映细胞增殖程度的指标。
２．３　核内复制
在ＤＮＡ复制的Ｓ期之后，细胞核未进行有丝分裂就开始了另一个Ｓ期的过程。其结果是染色体有４、８、１６倍的染色单体。
２．４　裂隙
染色体或染色单体损伤的长度小于一个染色单体的宽度，为染色单体的最小错误排列。
３　试验目的和原理
通过检测受试物是否诱发体外培养的哺乳类细胞染色体畸变，评价受试物致突变的可能性。在加入或不加入代谢活化系统的条件下，使培养的哺乳类细胞暴露于受试物中。用中期分裂相阻断剂（如秋水仙素或秋水仙胺）处理，使细胞停止在中期分裂相，随后收获细胞、制片、染色、分析染色体畸变。
４　仪器和试剂
４．１　仪器
细胞培养箱，倒置显微镜，超净台，离心机。
GB １５１９３．２３-２０１４
４．２　培养液
常用Ｅａｇｌｅ’ｓＭＥＭ培养液（ｍｉｎｉｍｕｍｅｓｓｅｎｔｉａｌｍｅｄｉｕｍ，ＭＥＭ），也可选用其他合适培养液。加入抗菌素（青霉素按１００ＩＵ／ｍＬ、链霉素１００μｇ／ｍＬ），将灭活的胎牛血清或小牛血清按１０％的比例加入培养液。
４．３　代谢活化系统
４．３．１　S９辅助因子的配制
４．３．１．１　镁钾溶液
氯化镁１．９ｇ和氯化钾６．１５ｇ加蒸馏水溶解至１００ｍＬ。
磷酸氢二钠（Ｎａ２ＨＰＯ４，２８．４ｇ／Ｌ）４４０ｍＬ，磷酸二氢钠（ＮａＨ２ＰＯ４·Ｈ２Ｏ，２７．６ｇ／Ｌ）６０ｍＬ，调ｐＨ
至７．４，０．１０３ＭＰａ２０ｍｉｎ灭菌或滤菌。
４．３．１．３　辅酶-Ⅱ（氧化型）溶液
无菌条件下称取辅酶-Ⅱ，用无菌蒸馏水溶解配制成０．０２５ｍｏｌ／Ｌ溶液，现用现配。
４．３．１．４　葡萄糖-６-磷酸钠盐溶液
称取葡萄糖-６-磷酸钠盐，用蒸馏水溶解配制成０．０５ｍｏｌ／Ｌ，过滤灭菌。现用现配。
４．３．２　大鼠肝S９组分的诱导和配制
选健康雄性成年 ＳＤ 或 Ｗｉｓｔａｒ大鼠，体重１５０ｇ～２００ｇ，约５周龄～６周龄。将多氯联苯（Ａｒｏｃｌｏｒ１２５４）溶于玉米油中，浓度为２００ｇ／Ｌ，按５００ｍｇ／ｋｇ体重无菌操作一次腹腔注射，５ｄ后处死动物，处死前禁食１２ｈ。
也可采用苯巴比妥钠和β-萘黄酮联合诱导的方法进行制备，经口灌胃给予大鼠苯巴比妥钠和β-萘黄酮，剂量均为８０ｍｇ／ｋｇ体重，连续３ｄ，禁食１６ｈ后断头处死动物。其他操作同多氯联苯诱导。
处死动物后取出肝脏，称重后用新鲜冰冷的０．１５ｍｏｌ／Ｌ氯化钾溶液连续冲洗肝脏数次，以便除去能抑制微粒体酶活性的血红蛋白。每克肝（湿重）加０．１ｍｏｌ／Ｌ氯化钾溶液３ｍＬ，连同烧杯移入冰浴中，用消毒剪刀剪碎肝脏，在玻璃匀浆器（低于４０００ｒ／ｍｉｎ，１ｍｉｎ～２ｍｉｎ）或组织匀浆器（低于２００００ｒ／ｍｉｎ，１ｍｉｎ）
中制成肝匀浆。以上操作需注意无菌和局部冷环境。
分装于无菌冷冻管中，每管２ｍＬ左右，最好用液氮或干冰速冻后置-８０℃低温保存。
Ｓ９组分制成后，经无菌检查，测定蛋白含量（Ｌｏｗｒｙ法），每毫升蛋白含量不超过４０ｍｇ为宜，并经间接致突变剂鉴定其生物活性合格后贮存于-８０℃低温或冰冻干燥，保存期不超过１年。
４．３．３　１０％S９混合液的制备
一般由Ｓ９组分和辅助因子按１∶９组成１０％的Ｓ９混合液，无菌现用现配。１０％Ｓ９混合液１０ｍＬ配制如下：
取上述磷酸盐缓冲液６．０ｍＬ、镁钾溶液０．４ｍＬ、葡萄糖-６-磷酸钠盐溶液１．０ｍＬ、辅酶-Ⅱ溶液１．６ｍＬ、肝Ｓ９组分１．０ｍＬ，混匀，置冰浴中待用。
Ｓ９混合液浓度一般为１％～１０％，实际使用浓度可由各实验室自行决定，但需对其活性进行鉴定，GB １５１９３．２３-２０１４
必须能明显活化阳性对照物，且对细胞无明显毒性。
４．４　秋水仙素溶液
用ＰＢＳ溶液配制适当浓度的储备液，过滤除菌，在避光冷藏的条件下至少能保存６个月。
５．５９ｇ氯化钾加蒸馏水至１０００ｍＬ。
４．６　固定液
甲醇∶冰醋酸为３∶１，临用前配制。根据试验条件，可适当调整冰醋酸的浓度，改善染色体分散度，但不宜过大，导致细胞破裂。
取姬姆萨染料３．８ｇ，置乳钵中，加少量甲醇研磨。逐渐加甲醇至３７５ｍＬ，待完全溶解后，再加１２５ｍＬ甘油，放入３７℃温箱中保温４８ｈ。保温期间振摇数次，使充分溶解。取出过滤，２周后使用，作为姬姆萨染液原液。使用时，取１份姬姆萨染液原液，与９份１／１５ｍｏｌ／Ｌ磷酸盐缓冲液（ｐＨ６．８）混合，配成其应用液，现配现用。
磷酸盐缓冲液（１／１５ｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ６．８）配制方法如下：
ａ）　第一液：取磷酸氢二钠（Ｎａ２ＨＰＯ４）９．４７ｇ溶于去离子水１０００ｍＬ中，配成１／１５ｍｏｌ／Ｌ溶液；
ｂ）　第二液：取磷酸二氢钾（ＫＨ２ＰＯ４）９．０７ｇ溶于去离子水１０００ｍＬ中，配成１／１５ｍｏｌ／Ｌ溶液；
ｃ）　取第一液５０ｍＬ加于第二液５０ｍＬ中混匀，即为ｐＨ６．８的１／１５ｍｏｌ／Ｌ磷酸盐缓冲液。
５　试验方法
５．１　受试物
固体受试物应溶解或悬浮于适合的溶媒中，并稀释至适当浓度。液体受试物可直接使用或稀释至适当浓度。受试物应无菌现用现配，否则须确认储存不影响其稳定性。
５．２　细胞株
可选用中国仓鼠肺（ＣＨＬ）细胞株或卵巢（ＣＨＯ）细胞株、人或其他哺乳动物外周血淋巴细胞（ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ）。试验前检查细胞的核型和染色体数目，检测细胞有无支原体污染。推荐使用中国仓鼠肺（ＣＨＬ）细胞株。
５．３　剂量
５．３．１　剂量设置
受试物至少应取３个检测剂量。对有细胞毒性的受试物，其剂量范围应包括从最大毒性至几乎无毒性（细胞存活率在２０％～１００％的范围内）；通常浓度间隔系数不大于２～槡１０。
５．３．２　最高剂量的选择
当收获细胞时，最高剂量应能明显减少细胞计数或有丝分裂指数（大于５０％，如毒性过大，应适当增加接种细胞数）；同时应该考虑受试物对溶解度、ｐＨ和摩尔渗透压浓度的影响；对无细胞毒性或细胞毒性很小的化合物，最高剂量应达到５μＬ／ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬ或１０ｍｍｏｌ／Ｌ。
GB １５１９３．２３-２０１４
对溶解度较低的物质，当达到最大溶解浓度时仍无毒性，则最高剂量应是在最终培养液中溶解度限值以上的一个浓度。在某些情况下，应使用一个以上可见沉淀的浓度，溶解性可用肉眼鉴别，但沉淀不能影响观察。
５．３．３　细胞毒性的确定
测定细胞毒性可使用指示细胞完整性和生长情况的指标，如相对集落形成率或相对细胞生长率等。