GB 15193.20-2014

GB 15193.20-2014
National Food Safety Standard.TK gene mutation test
中华人民共和国国家标准
食品安全国家标准
体外哺乳类细胞TK基因突变试验
2014-12-24发布
2015-05-01实施
中 华 人 民 共 和 国
国家卫生和计划生育委员会 发 布
前言
本标准代替GB 15193.20-2003《TK基因突变试验》。
本标准与GB 15193.20-2003相比,主要变化如下:
---标准名称修改为“食品安全国家标准 体外哺乳类细胞TK基因突变试验”;
---修改了范围;
---增加了术语和定义;
---修改了试验目的和原理;
---增加了代谢活化系统;
---增加了THMG和THG选择培养基的配制方法;
---增加了CHAT和CHT选择培养基的配制方法;
---增加了三氟胸苷的配制方法;
---增加了磷酸盐缓冲液的配制方法;
---修改了受试物剂量设定的要求;
---修改了对照的设定;
---增加了备选细胞系及相应的试验方法及数据处理;
---增加了试验报告的要求;
---增加了试验的解释的要求。
食品安全国家标准
体外哺乳类细胞TK基因突变试验
1 范围
本标准规定了体外哺乳类胸苷激酶(thymidinekinase,TK)基因突变试验的基本试验方法与技术
要求。
本标准适用于评价受试物的致突变作用。
2 术语和定义
2.1 TK基因
哺乳类动物的胸苷激酶基因。人类的 TK基因定位于17号染色体长臂远端;小鼠的则定位于
11号染色体。
2.2 突变频率
在某种细胞系中,某一特定基因突变型的细胞(集落)占细胞(集落)总数的比例(单位通常为10-6)。
3 试验目的和原理
TK基因突变试验的检测终点是TK基因的突变。TK基因突变属于常染色体基因突变。
TK基因的产物胸苷激酶在体内催化从脱氧胸苷(TdR)生成胸苷酸(TMP)的反应。在正常情况
下,此反应并非生命所必需,原因是体内的TMP主要来自于脱氧尿嘧啶核苷酸(dUMP),即由胸苷酸合成酶催化的dUMP甲基化反应生成TMP。但如在细胞培养物中加入胸苷类似物(如三氟胸苷,即trifluorothymidine,TFT),则TFT在胸苷激酶的催化下可生成三氟胸苷酸,进而掺入DNA,造成致死性突变,故细胞不能存活。若TK基因发生突变,导致胸苷激酶缺陷,则TFT不能磷酸化,亦不能掺入DNA,故突变细胞在含有TFT的培养基中能够生长,即表现出对TFT的抗性。根据突变集落形成数,可计算突变频率,从而推断受试物的致突变性。在TK基因突变试验结果观察中可发现两类明显不同的集落,即大/小集落(L5178Y细胞)或正常生长/缓慢生长集落(TK6细胞),有研究表明,大集落/正常生长集落主要由点突变或较小范围的缺失等引起,而小集落/缓慢生长集落主要由较大范围的染色体畸
变,或由涉及调控细胞增殖的基因缺失引起。
4 仪器和试剂
4.1 仪器
实验室常用设备、低温冰箱(-80℃)或液氮罐、生物安全柜、细胞培养箱、倒置显微镜、离心机。
4.2 培养基
4.2.1 完全培养基
RPMI1640培养液,加入10%马血清(培养瓶培养)或20%马血清(96孔板培养)及适量抗菌素(青
霉素、链霉素的最终浓度分别为100IU/mL及100μg/mL)。
4.2.2 THMG和THG选择培养基
THMG培养基:3μg/mL胸腺嘧啶核苷(thymidine,T)+5μg/mL次黄嘌呤(hypoxanthine,H)
+0.1μg/mL氨甲喋呤(methotrexate,M)+7.5μg/mL甘氨酸(glycine,G)。
THG培养基:3μg/mL胸腺嘧啶核苷(T)+5μg/mL次黄嘌呤(H)+7.5μg/mL甘氨酸(G)。
以上浓度为各试剂在培养基中的终浓度。实际试验中,常按照表1的方法把THMG和THG配成
100倍浓度:
表1 T、H、M、G试剂的配置
试剂 相对分子质量 质量/mg 溶剂及其体积 浓度/(mg/mL)
T 242.2 30 10mLH2O 3
H 136.1 5 1mL1mol/LHCl 5
M 454.5 5 50mLH2O 0.1
G 75.07 75 10mLH2O 7.5
将4种试剂配制成上述1000倍浓度,再分别取此浓度的T、H、M、G溶液各5mL(共20mL)或
T、H、G溶液各5mL(共15mL),均用双蒸水稀释至50mL,配成100倍的THMG或THG储备液。
最后用滤膜过滤除菌,分装,-20℃下保存。应用时以1%的比例加入完全培养基。
4.2.3 CHAT和CHT选择培养基
CHAT培养基:1×10-5mol/L脱氧胞苷(cytosinedeoxyriboside,C)+2×10-4 mol/L次黄嘌呤
(hypoxnathine,H)+1×10-7mol/L氨基喋呤(aminopterin,A)+1.75×10-5mol/L胸苷(thymidine,T)。
CHT培养基:1×10-5mol/L脱氧胞苷(C)+2×10-4mol/L次黄嘌呤(H)+1.75×10-5mol/L胸
苷(T)。
以上浓度为各试剂在培养基中的终浓度。实际试验中,常按表2的方法把CHAT和CHT配成
100倍浓度:
表2 C、H、A、T试剂的配置
试剂 相对分子质量 质量/mg 溶剂及其体积 浓度/(mol/L)
C 227.2 113.6 50mLH2O 1×10-2
H 136.1 1361.0 50mL1mol/LHCl 2×10-1
A 440.4 2.2 50mLH2O 1×10-4
T 242.2 423.85 10mLH2O 1.75×10-2
将4种试剂配制成1000倍浓度,再分别取此浓度的C、H、A、T溶液各5mL(共20mL)或C、H、T
溶液各5mL(共15mL),均用双蒸水稀释至50mL,配成100倍的CHAT或CHT储备液。最后用滤
膜过滤除菌,分装,-20℃下保存。应用时以1%的比例加入完全培养基。
4.3 代谢活化系统
4.3.1 S9辅助因子
4.3.1.1 镁钾溶液
氯化镁1.9g和氯化钾6.15g加蒸馏水溶解至100mL。
4.3.1.2 0.2mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.4)
磷酸氢二钠(Na2HPO4,28.4g/L)440mL,磷酸二氢钠(NaH2PO4·H2O,27.6g/L)60mL,调pH
至7.4,0.103MPa20min灭菌或滤菌。
4.3.1.3 辅酶-Ⅱ(氧化型)溶液
无菌条件下称取辅酶-Ⅱ,用无菌蒸馏水溶解配制成0.025mol/L溶液。现用现配。
4.3.1.4 葡萄糖-6-磷酸钠盐溶液
称取葡萄糖-6-磷酸钠盐,用蒸馏水溶解配制成0.05mol/L,过滤灭菌。现用现配。
4.3.2 大鼠肝S9组分的制备
选健康雄性成年SD或 Wistar大鼠,体重150g~200g左右,约5周龄~6周龄。采用苯巴比妥钠
和β-萘黄酮联合诱导的方法进行制备,经口灌胃给予大鼠苯巴比妥钠和β-萘黄酮,剂量均为80mg/kg体重,连续3d,禁食16h后断头处死动物,处死前禁食12h。
处死动物后取出肝脏,称重后用新鲜冰冷的氯化钾溶液(0.15mol/L)连续冲洗肝脏数次,以便除去
能抑制微粒体酶活性的血红蛋白。每克肝(湿重)加氯化钾溶液(0.1mol/L)3mL,连同烧杯移入冰浴中,用消毒剪刀剪碎肝脏,在玻璃匀浆器(低于4000r/min,1min~2min)或组织匀浆器(低于
20000r/min,1min)中制成肝匀浆。以上操作需注意无菌和局部冷环境。
将制成的肝匀浆在低温(0℃~4℃)高速离心机上以9000g离心10min,吸出上清液为S9组分,
分装于无菌冷冻管中,每管2mL左右,用液氮或干冰速冻后置-80℃低温保存。
S9组分制成后,经无菌检查,测定蛋白含量(Lowry法),每毫升蛋白含量不超过40mg为宜,并经
间接致突变剂鉴定其生物活性合格后贮存于-80℃低温或冰冻干燥,保存期不超过1年。
4.3.3 10%S9混合液
一般由S9组分和辅助因子按1∶9组成10%的S9混合液,无菌,现用现配或过滤除菌。10%S9
混合液10mL配制如下:
磷酸盐缓冲液 6.0mL
镁钾溶液 0.4mL
葡萄糖-6-磷酸钠盐溶液 1.0mL
辅酶-Ⅱ溶液 1.6mL
肝S9组分 1.0mL
混匀,置冰浴中待用。
S9混合液浓度一般为1%~10%,实际使用浓度可由各实验室自行决定,但需对其活性进行鉴定,
应能明显活化阳性对照物,且对细胞无明显毒性。
4.4 磷酸盐缓冲液(phosphatebuefferdsaline,PBS)
将8.0gNaCl、0.20gKCl、2.74gNa2HPO4·7H2O、0.20gKH2PO4 溶于双蒸水并定容至
1000mL,pH7.2~7.4。
4.5 三氟胸苷(trifluorothymidine,TFT)的配制
取TFT30mg,用PBS溶解加至10mL,配成3mg/mL的储备液。应用时按1‰的体积比加入培
养基。
5 试验方法
5.1 细胞和培养条件
tk+/-基因型的L5178Y-3.7.2C小鼠淋巴瘤细胞或TK6人类淋巴母细胞。
两种细胞均在5%二氧化碳、37℃、饱和湿度条件下作常规悬浮培养。
为避免在培养和传代期间自发突变的细胞对试验结果的影响,在正式试验前,应清除自发突变的
tk-/-基因型细胞。方法是:
a) 对于L5178Y细胞,使用THMG培养基处理24h,以800r/min~1000r/min的速度离心
4min~6min、洗涤后在不含氨甲喋呤的THG培养基中培养2d;
b) 对于TK6细胞,使用CHAT培养基处理48h,以800r/min~1000r/min的速度离心4min~
6min、洗涤后在不含氨基喋呤的CHT培养基中继续培养3d。
5.2 受试物
5.2.1 受试物的配制
受试物在使用前应现用现配,否则须证实在特定贮存条件下不影响其稳定性。
5.2.2 受试物剂量设定
至少应设置3个~4个可供分析的浓度。对于有细胞毒性的受试物,应根据细胞毒性预试验结果,
在RS或RSG为20%~80%范围内设3个~4个剂量(浓度)水平,同时应该考虑受试物对溶解度、pH
和摩尔渗透压浓度的影响。方法是:取生长良好的细胞,调整密度为5×105/mL,按1%体积加入不同浓度受试物,37℃震摇处理3h(L5178Y细胞)或4h(TK6细胞),细胞经离心洗涤后,作2d(L5178Y
细胞)或3d(TK6细胞)表达培养,每天计数细胞密度并计算相对悬浮生长(RSG)。或取上述处理后细胞悬液,作梯度稀释至8个细胞/mL,接种96孔板(每孔加0.2mL,即平均1.6个细胞/孔),每个剂量种1块~2块平板,37℃,5%二氧化碳,饱和湿度条件下培养12d,计数每块平板有集落生长的孔数,计算 相对存活率(RS)。
对于细胞毒性极低的受试物,最高浓度应设为5mg/mL、5μL/mL或0.01mol/L。对于相对不溶
解的物质,其最高浓度的设置应达到不影响细胞培养的最大可加入浓度。
5.2.3 对照的设定
一般情况下,每一项试验中,在代谢活化系统存在和不存在的条件下均应设阳性和阴性(溶媒)对
照组。
当使用代谢活化系统时,阳性对照物应使用要求代谢活化、并能引起典型突变集落的物质,可以使用3-甲基胆蒽(3-methylcholanthrene)、环磷酰胺(cyclophosphamide,CP)等。在没有代谢活化系统时,
阳性对照物可使用甲基磺酸甲酯(methylmethanesulfonate,MMS)、丝裂霉素 C(mitomycinC,
MMC)、甲基磺酸乙酯(ethylmethanesulfonate,EMS)等。也可使用其他适宜的阳性对照物。
溶媒应是非致突变物,不与受试物发生化学反应,不影响细胞存活和S9活性。溶媒首选蒸馏水,如
使用非水溶媒(可选择二甲基亚砜、丙酮、乙醇等),则需增设溶媒对照。
5.3 处理
取生长良好的细胞,调整密度为5×105/mL,按1%体积加入受试物(需代谢活化的情况下,同时加
入终浓度为1%~10%的S9混合物),37 ℃振摇处理3h(L5178Y 细胞)或4h(TK6细胞),以
800r/min~1000r/min的速度离心4min~6min,弃上清液,用PBS或不含血清的培养基洗涤细胞
2遍,重新悬浮细胞于含10%马血清的RPMI1640培养液中,并调整细胞密度为2×105/mL。
5.4 PE0(0d的平板接种效率)测定取适量细胞悬液,作梯度稀释至8个细胞/mL,接种96孔板(每孔加0.2mL,即平均1.6个细胞/孔),每个剂量种1块~2块平板,37℃,5%二氧化碳,饱和湿度条件下培养12d,计数每块平板有集落生长的孔数。
5.5 表达
取5.3所得细胞悬液,作2d(L5178Y细胞)或3d(TK6细胞)表达培养,每天计数细胞密度并保持
密度在106/mL以下,计算相对悬浮生长(RSG)。
5.6 PE2(L5178Y细胞)或PE3(TK6细胞)测定
表达培养结束后,取适量细胞悬液,按5.4方法测定PE2/PE3。
5.7 突变频率(MF)测定
5.7.1 L5178Y细胞
L5178Y细胞表达培养2d后,取适量细胞悬液,调整细胞密度为1×104/mL,加入TFT(终浓度为
3μg/mL),混匀,接种96孔板(每孔加0.2mL,即平均2000个细胞/孔),每个剂量作2块~4块板,
37℃,5%二氧化碳,饱和湿度条件下培养12d,计数有突变集落生长的孔数。突变集落按大集落
(LargeColony,LC:直径≥1/4孔径,密度低)和小集落(smalcolony,SC:直径<1 br=""> 别计数。极小集落可再继续培养3d后计数。